На протяжении многих лет меня часто спрашивали, может ли прибор VITEK® 2 обеспечить получение «реальной» или «достоверной» минимальной ингибирующей концентрации. Для того, чтобы ответить на этот вопрос, следует сперва понять, что такое достоверная минимальная ингибирующая концентрация (МИК). Когда микробиологов и других работников лабораторий спрашивают «Что такое реальная или достоверная минимальная ингибирующая концентрация?», они обычно дают один из нижеприведенных ответов:

  • Это референсный метод.
  • Результат можно считать вручную.
  • Не требуется проводить расчеты результатов.
  • Для каждой полученной МИК имеется лунка с соответствующей концентрацией антибиотика.
  • Имеется наличие большого количества двукратных разведений.
  • Дикий тип организмов можно дифференцировать от организмов недикого типа.

Так что, давайте рассмотрим эти разные определения «реальной» или «достоверной» минимальной ингибирующей концентрации.

Является ли это референсным методом?

Если бы это было так, то большая часть in vitro диагностических систем (IVD) не квалифицировалась бы как «реальная» или «достоверная» система определения минимальной ингибирующей концентрации. Только те методы, которые строго следуют требованиям Международной организации по стандартизации (ISO) 20776-1:2006 (E)1 и требованиям института клинических и лабораторных стандартов (CLSI) M07-A102 могут квалифицироваться как предоставляющие «реальные» или «достоверные» данные по минимальной ингибирующей концентрации. Существует очень мало производителей IVD систем, которые в действительности предоставляют контрольные панели для определения минимальной ингибирующей концентрации. Согласно ISO и CLSI они должны быть в замороженном формате. Панели с высушенными субстратами и реагентами, к примеру, не могут считаться эквивалентными референсному методу. Так что это определение референсного метода является очень ограниченным.

Означает ли это, что данные могут быть считаны вручную, что требуется инкубация в течение всей ночи и/или что не требуется выполнять расчеты результатов?

Могут ли системы IVD, в которых показания снимаются вручную, для которых требуется инкубация в течение всей ночи и/или не требуется выполнять расчеты результатов, на самом деле давать более «реальные» или «действительные» значения МИК, чем те системы, которые всего этого не могут? Приборы для определения чувствительности к противомикробным препаратам (AST – antimicrobial susceptibility testing) демонстрируют достаточную эффективность , эквивалентную референсному методу, но фактически не достаточную, чтобы являться референсным мотодом.

Обдумайте тот факт, что все системы, которые не являются референсными методами, требуют клинических исследований (т.е. исследования эффективности) для демонстрации эквивалентности референсному методу для получения разрешения от US-FDA (Управления по надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США) или для CE-маркировки. Это включает в себя традиционные 96-луночные планшеты в формате панели с высушенными рективами. В этих случаях – независимо от способа получения результатов МИК – эффективность клинического исследования, указанная на производственной маркировке продукта является достоверным показателем эффективности этих систем в сравнении с золотым стандартом референсного метода.

US-FDA и ISO имеют одинаковые, очень строгие критерии эффективности, которым системы IVD AST должны соответствовать для получения разрешения или регистрации независимо от методологии.

  • >90% принципиального соответствия (это процент соответствия времени, которое необходимо для получения МИК в случае испытуемого метода +/- 1 по сравнению с методом последовательных двукратных разведений в качестве референсного метода).
  • >90% соответствия категории (процент случаев, когда чувствительная (S), промежуточная (I) или устойчивая (R) интерпретация МИК испытуемого метода соответствует S, I или R интерпретациям референсного метода).
  • <3.0% основных погрешностей, касаемо только чувствительных изолятов (основные погрешности касаются изолятов, которые интерпретируются как чувствительные (S) при использовании референсного метода и устойчивые (R) при использовании испытуемого метода).
  • FDA и ISO имеют разную приемлемую степень очень важной погрешности (VME – very major error). (VME касается изолятов, которые интерпретируются как устойчивые (R) при использовании референсного метода и как чувствительные (S) при использовании испытуемого метода).
    • Для регулирующих критериев FDA степень очень важной погрешности должна быть основана на устойчивых изолятах только с предполагаемыми статистическими критериями приемлемости с верхним и нижним 95%-ным доверительным интервалом для достоверной степени очень важной погрешности < 7.5% и < 1.5%, соответственно.
    • o VME для ISO должна быть <3.0% на основании только устойчивых изолятов.
Для получения подробной информации о критериях эффективности US-FDA см. 2009 Руководящий документ по специальному контролю класса II, 2009 г. Системы для исследования чувствительности к противомикробным препаратам (AST)3. Для получения подробной информации о требованиях ISO см.:ISO 20776-2: 2007 (E)4.

VITEK® 2 является разрешенным US FDA и CE маркированным анализатором, который требует подтверждения, что определяемая им минимальная ингибирующая концентрация соответствует данным, полученным референсным методом. Даже если результаты, полученные на приборе VITEK® 2 для определения чувствительности к противомикробным препаратам (AST), не могут быть считаны вручную, не требуют инкубации в течение всей ночи и дают расчетные данные по минимальной ингибирующей концентрации, эти результаты согласуются с результатами референсного метода, как указано на СЕ-маркировке всех антибиотиков, клинически применимых для человека, предложенных в VITEK® 2 и в разрешении FDA для большинства из них.

И еще один момент по этому поводу – считывание результатов МИК вручную может потребовать больших затрат времени и является довольно субъективным. Результаты, полученные на анализаторе, определяющем чувствительность к противомикробным препаратам, VITEK® 2, соответствуют результатам, полученным референсным методом, но в данном случае предлагаются также дополнительные преимущества получения объективных, воспроизводимых и быстрых результатов. Фактически, результаты, полученные на анализаторе VITEK® 2, могут быть рассмотрены как более стандартизированные, чем полученные на системах, позволяющих считывание результатов вручную, так как автоматическое считывание исключает субъективный человеческий фактор интерпретации результатов – результаты, полученные для одного изолята, являются одинаковыми независимо от того, кто выполняет исследование.

Хорошо, но является ли важным моментом для получения «реальной» или «достоверной» МИК наличие лунки для каждой заявленной минимальной ингибирующей концентрации, большого количества двукратных разведений и/или дифференцирования организмов дикого типа от других организмов? 

Сначала несколько слов о двукратных разведениях. Физическое наличие двукратных разведений не делает систему референсным методом. Например, автоматические экспресс-системы явно не соответствуют условиям исследования референсным методом, так как последний требует 16–24-часовую инкубацию в зависимости от комбинации организм/противомикробный препарат. Однако, несмотря на это по данным клинического исследования эффективности для этих систем установлена существенная эквивалентность с референсным методом.

Желательным, но часто непрактичным, является большой диапазон минимальной ингибирующей концентрации для широкого разнообразия антибиотиков, которые следует исследовать на каждом изоляте. По мере увеличения устойчивости микроорганизмов приходится тестировать больше антибиотиков, но пространство на одноразовых системах AST ограничено. Многие AST-устройства предназначены для исследования чувствительности на своих панелях только тех концентраций, которые необходимы для интерпретации МИК большинства антибиотиков. Анализатор VITEK® 2 анализирует данные диапазона МИК в семи двукратных разведениях большинства антибиотиков, часто охватывая эпидемиологическую точку отсечения, используемую для дифференцирования штаммов дикого типа от мутантного типа. Это обеспечивает анализатору VITEK® 2 большой диапазон применения в сравнении с аналогичными быстрыми, автоматическими системами ID and AST. ISO и FDA установлены критерии для исследования МИК тест-системами или на анализаторах, которым отвечает большинство антибиотиков на анализаторе VITEK® 2:

  • Согласно ISO 20776-24, определение МИК является «тестом, который способен определять минимальную ингибирующую концентрацию в диапазоне, охватывающем по меньшей мере пять последовательных двукратных разбавлений, и для которого может быть определено принципиальное соответствие (ЕА)»..
  • В руководящем документе FDA по специальному контролю класса II3 системы для определения МИК определяются, как: «разбавление бульона, разбавление агара или другие методы или системы, по меньшей мере, с пятью концентрациями, обычно в двукратном разбавлении противомикробных агентов» с дополнительной спецификой, которая явно имеется в анализаторе VITEK® 2, так как большинство антибиотиков в этой системе разрешены FDA для получения количественных результатов по минимальной ингибирующей концентрации, а не результатов качественной категории (SIR).
  • FDA определяет также системы контрольных точек, как: «системы аналогичные по дизайну системам определения минимальной ингибирующей концентрации, но с четырьмя или меньше концентрациями каждого противомикробного агента. Эти концентрации являются интерпретационными пороговыми значениями (на основании интерпретационных категориальных значений FDA по минимальной ингибирующей концентрации для каждого противомикробного агента), которые дают качественный результат. FDA считает эти устройства качественными.» 3

Итак, какой же вывод можно сделать в нашем обсуждении «достоверной» минимальной ингибирующей концентрации?

CLSI M07-A102 сомнительно определяет «достоверную» минимальную ингибирующую концентрацию, следующим образом: «»достоверная» минимальная ингибирующая концентрация находится где-то между самой низкой испытуемой концентрацией, которая ингибирует рост микроорганизма (т.е. показание МИК), и следующей самой низкой испытуемой концентрацией. Если, к примеру, используются двукратные разведения и МИК равен 16 мкг/мл, «достоверная» МИК будет находиться между 16 мкг/мл и 8 мкг/мл». Если используется это определение, то ни одно AST устройство, включая референсный метод, не дает «реальное» или «достоверное» значение минимальной ингибирующей концентрации. И наконец, наиболее важным соображением является то, что значения минимальной ингибирующей концентрации являются точными!

И, наконец, что является очевидным в вопросе минимальной ингибирующей концентрации и анализатора VITEK® 2?

В следующий раз, когда вы захотите узнать, является ли МИК, полученная на вашей системе AST «достоверной», вспомните, что для CE‑маркировки или разрешения FDA является важным то, что применяемый метод должен показывать эффективность, эквивалентную референсному методу, что демонстрируется данными клинического исследования, указанными на маркировке прибора. Этот набор данных требуется законом и обычно проводится каждым производителем системы нереференсного метода определения МИК для установления эквивалентности с референсным методом. Это является большим преимуществом, что устройство AST, такое как VITEK® 2, обеспечивает возможность проведения точного, воспроизводимого и быстрого определения МИК в системе процесса лабораторной диагностики.

Список литературы

  1. ISO.  Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems — Susceptibility test of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices –Part 1:  Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases-First Edition.  ISO document 20776-1.  Switzerland:  ISO; 2006.

  2. CLSI. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically; Approved Standards, 10th Ed. CLSI document M07-A10. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2015.

  3. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Devices and Radiological Health.  Class II Special Controls Guidance Document:  Antimicrobial Susceptibility Test (AST) Systems. https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/class-ii-special-controls-guidance-document-antimicrobial-susceptibility-test-ast-systems.  U.S. Department of Health and Human Services; 2009.

  4. ISO.  Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems — Susceptibility test of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices – Part 2:  Evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices-First Edition.  ISO document 20776-1.  Switzerland:  ISO; 2007.

Акронимы:

  • S: чувствительный

  • I: промежуточно-чувствительный

  • R: устойчивый