W artykule należącym do serii publikacji dotyczących wartości MIC (minimalne stężenia hamujące) skupiliśmy się na tym, czym jest „prawdziwa” lub „rzeczywista” wartość MIC. Dowiedzieliśmy się, że zdecydowana większość zautomatyzowanych systemów ID and AST nie jest zgodna z wymaganiami protokołów referencyjnych metod wyznaczania wartości MIC określonych przez International Organization for Standardization (Międzynarodową Organizacją Normalizacyjną, ISO) 20776-1:2006 (E)1 oraz Clinical and Laboratory Standards Institute (Instytut Standardów Klinicznych i Laboratoryjnych, CLSI) M07-A10. Z tego względu producenci systemów zautomatyzowanych są zobowiązani do generowania danych dotyczących skuteczności testów klinicznych w celu weryfikacji równoważności ich procedur z metodą referencyjną. Stanowi to potwierdzenie, że wyznaczane w ich systemach wartości MIC, są „prawdziwe” lub „rzeczywiste”. W niniejszym artykule zbadamy typ danych wejściowych gromadzonych w systemie VITEK® 2 oraz sposób przekształcania ich w dokładną wartość MIC.

Jak monitoruje się wzrost mikroorganizmu?

Izolaty pacjenta są badane w VITEK® 2 przy użyciu pojedynczej, zawierającej wszystkie odczynniki, jednorazowej karty AST (rysunek 1) stosowanej do oznaczania jednego izolatu. Każda karta zawiera co najmniej jedną studzienkę kontroli dodatniej bez antybiotyku (jedynie z bulionem wzrostowym) oraz wiele studzienek ze wzrastającymi stężeniami różnych antybiotyków w bulionie.

VITEK® 2 stale monitoruje wzrost mikroorganizmu we wszystkich studzienkach. Wzrost w studzience kontroli dodatniej jest sprawdzany do momentu osiągnięcia wcześniej określonego minimalnego poziomu wzrostu mikroorganizmu określanego poprzez pomiary zmętnienia (tj. procentową zmianę jednostkowej przepuszczalności podstawowej – raw transmittance unit -% ΔRTU). Wzrost w studzience kontrolnej wykazuje, że badany izolat zawiera żywe kultury mikroorganizmu i rozwija się z odpowiednią szybkością, umożliwiającą rozpoczęcie analizy dla pozostałych studzienek. Analiza ta odbywa się co 15 minut, aż do zakończenia oznaczania antybiotykowrażliwości.

Jak pokazano na rysunku 2, wzrost organizmu jest mierzony na kilka sposobów. Zarówno w studzience kontroli dodatniej, jak i w studzienkach zawierających antybiotyki. Względny wzrost mikroorganizmu w każdej studzience z antybiotykiem jest także porównywany ze wzrostem w studzience (studzienkach) kontroli dodatniej.


Rysunek 1: Karta VITEK® 2 AST
Powiększ


Rysunek 2: Zasada określania wartości MIC w systemie VITEK® 2
Powiększ

Jak określana jest wartość MIC?

Wartość MIC określa się przez porównanie wzrostu izolatu pacjenta ze wzrostem izolatów ze znanymi wartościami MIC. To jak posiadanie krzywej kalibracji zapisanej w pamięci systemu VITEK®2, gdzie krzywa służy do powiązania wartości MIC odniesienia z aktywnością mikroorganizmu w studzienkach z antybiotykiem.

Warto zauważyć, że „krzywe kalibracji” w VITEK® 2:

  • Są wielowymiarowe, ponieważ VITEK® 2 nieustannie sprawdza wiele parametrów (w przeciwieństwie do pojedynczego odczytu końcowego po całonocnej inkubacji).
  • Zostały stworzone przy użyciu > 1800 organizmów Gram-ujemnych i > 1200 organizmów Gram‑dodatnich charakteryzujących się różnymi mechanizmami oporności.

Ponieważ system VITEK® 2 nieustannie kontroluje wzrost w czasie i wykorzystuje wiele parametrów w celu monitorowania wzrostu (w przeciwieństwie do pojedynczego odczytu końcowego po całonocnej inkubacji), nie ma potrzeby posiadania studzienki dla każdej wartości MIC podawanej w raporcie. Pojedyncza studzienka jest w stanie dostarczyć informacji o więcej niż jednej wartości MIC, ponieważ aktywność organizmu w studzience może być mierzona, co związane jest z większą ilością informacji, niż informacja o zwykłym wzroście lub jego braku.

Jakie jest znaczenie ciągłego monitorowania?

Aby zilustrować znaczenie ciągłego monitorowania aktywności mikroorganizmu, spójrzmy na test VITEK®2 AST, który może określać wartości MIC dla serii dwukrotnych rozcieńczeń przy stężeniu antybiotyku wynoszącym 0,25 mg/ml do ≥ 8 mg/ml. Wykresy od 1 do 6 ilustrują związek między danymi uzyskiwanymi przez system VITEK®2 a wynikami uzyskanymi za pomocą metody referencyjnej.

Każdy wykres przedstawia obserwowany w systemie VITEK® 2 wzrost określonego mikroorganizmu przy różnych wartościach MIC odniesienia. Jednym z pierwszych wniosków wynikających z analizy wykresów jest fakt, że można interpretować aktywność wzrostu mikroorganizmu dla różnych stężeń antybiotyków w bardziej zaawansowany sposób niż tylko proste stwierdzenie obecności wzrostu lub jego braku. Przy zaledwie trzech stężeniach VITEK® 2 może określić sześć unikalnych wzorów wzrostu, co pozwalana określenie sześciu różnych wartości MIC.

Inną kluczową funkcją analizy VITEK® 2 jest możliwość standaryzacji danych dla badanego organizmu przez porównanie wzrostu dla każdego stężenia antybiotyku ze wzrostem w studzience kontrolnej. Krok ten jest niezbędny do określenia względnego wzrostu mikroorganizmu, ponieważ kształt krzywych wzrostu jest różny dla różnych typów mikroorganizmów. Długość fazy wstępnej, nachylenie krzywej zmian w fazie wykładniczego wzrostu oraz wielkość zmian w fazie wykładniczego wzrostu pozwalają określić niepowtarzalny zestaw cech wzrostu danego mikroorganizmu.

Aby zrozumieć proces standaryzacji danych, można przyjrzeć się – na przykład – wzrostowi w studzience 0,5 μg/ml w porównaniu do wzrostu w studzience kontroli wzrostu na wykresie 2. Badany organizm charakteryzuje się wartością MIC wynoszącą 0,5 μg/ml. Wzrost dla 0,5 μg/ml wynosi w przybliżeniu 60% wzrostu w studzience kontrolnej. Na wykresie 3 mikroorganizm ma wartość MIC wynoszącą 1 μg/ml, a jego aktywność przy stężeniu 0,5 μg/ml wynosi 95% wzrostu w czystym bulionie. Powyższe wartości procentowe oraz względne wartości wzrostu mikroorganizmu są używane przez system VITEK® 2 do określenia dokładnych wartości MIC.

 


Wykresy 1-6
Powiększ

 

Na przykład: w poniższej Tabeli 1 podsumowano analizę VITEK® 2 względnego wzrostu mikroorganizmu dla danych na wykresach 1 do 6. Tabela przedstawia liczbowy związek między wzrostem organizmu określonym przez system VITEK® 2 i referencyjną metodą określania wartości MIC.

Mikroorganizm/ wykres

Referencyjna wartość

MIC

 Stężenie antybiotyku
0.5 2.0 8.0
1 ≤ 0.25 3% 2% 1%
2 0.5 60% 3% 1%
3 1.0 90% 8% 2%
4 2.0 95% 50% 8%
5 4.0 99% 92% 9%
6 ≥ 8.0 100% 100% 99%

Tabela 1: Względny wzrost mikroorganizmu – wzrost w studzience z antybiotykiem w porównaniu do wzrostu w studzience kontrolnej wyrażony jako wartość procentowa

Sporządzając wykres względnych wartości wzrostu mikroorganizmu dla dużego zestawu mikroorganizmów i trzech stężeń antybiotyków podanych w Tabeli 1 (0,5, 2 i 8 mg/ml) otrzymujemy wykres 1. Wykres 1 służy jako krzywa wzorcowa, gdzie:
  • Każdy wymiar reprezentuje względny wzrost dla jednego stężenia antybiotyku.
  • Każdy diament reprezentuje punkt odpowiadający trzem względnym wartościom wzrostu mikroorganizmu dla danego mikroorganizmu.
  • Różne grupy kolorów przedstawiają zestaw mikroorganizmów o wartości referencyjnej MIC w zakresie od 0,25 mg/ml do ≥ 8,0 g/ml.

 

Plot 1: Relative Organism Growth Over a Large Set of Organisms
Each diamond represents a single organism

 

Jako przykład, diament dla danych podanych w Tabeli 1, na Wykresie 3 znalazłby się w punkcie (90%, 8%, 2%). Wartość 90% zostanie wykreślona na osi 0,5 mg/ml, 8% na osi 2,0 mg/ml, a 2% na osi 8,0 mg/ml. Ponieważ organizm ma wartość MIC wynoszącą 1,0 mg/ml, diament będzie czerwony (na podstawie klucza kolorów referencyjnych wartości MIC podanego w górnym prawym rogu wykresu). Ogólnie rzecz ujmując, trójwymiarowy wykres przedstawia unikalną zdolność systemu VITEK® 2 do określenia sześciu różnych wartości MIC przy trzech stężeniach antybiotyku. Ponadto widać, jak określenie względnego wzrostu organizmu umożliwia systemowi VITEK® 2 uwzględnienie unikalnej charakterystyki wzrostu każdego mikroorganizmu w celu określenia wartości MIC.

Nieustanne monitorowanie aktywności mikroorganizmu pomaga określić wartość MIC, jak również czas inkubacji niezbędny mikroorganizmowi w systemie VITEK® 2. Dzięki znajomości czasu, po którym mikroorganizm przejdzie z fazy wstępnej do fazy wykładniczego wzrostu, oprogramowanie analityczne jest w stanie określić odpowiedni czas inkubacji w oparciu o wzrost wykazywany przez każdy mikroorganizm:

  1. Po zakończeniu fazy wstępnej kontroli wzrostu, system VITEK® 2 czeka przez określony czas.
  2. Następnie VITEK® 2 sprawdza, czy wystąpił wzrost przy najniższym stężeniu antybiotyku.
  3. Jeśli w tym czasie wzrost w dalszym ciągu ma miejsce, VITEK® 2 przedłuża inkubację o dalszą, ustaloną z góry, ilość czasu w celu oceny wzrostu dla pozostałych stężeń.
  4. Proces przedłużania czasu trwa aż:
    1. nie wystąpi dalszy znaczny wzrost, lub
    2. nie wystąpi wzrost przy najwyższym stężeniu

Dzięki tej procedurze VITEK® 2 charakteryzuje się stosunkowo krótkim okresem inkubacji w przypadku większości mikroorganizmów, ponieważ w końcu to mikroorganizm dyktuje czas trwania inkubacji. Instrument po prostu dostosowuje się do wykrywanego wzrostu. Ma to dodatkową zaletę polegającą na wykrywaniu oporności o opóźnionym charakterze.

Jakie są ograniczenia systemu?

Procedury określania wartości MIC stosowane w systemie VITEK® 2 zrywają z tradycyjnym podejściem. Jednak dbałość o tradycję nie jest celem nauki. Wręcz przeciwnie, musimy szukać bardziej skutecznych, wydajnych i dokładnych sposobów działania. Zdolność systemu VITEK® 2 do ciągłego monitorowania aktywności mikroorganizmu w celu określenia czasu trwania inkubacji oraz wartości MIC pozwala skrócić czas oczekiwania na wynik w porównaniu do metod tradycyjnych. A podczas badań klinicznych wielokrotnie udowodniano, że opisana tu metoda pozwala uzyskać dokładne i powtarzalne wyniki.