W ciągu wielu lat często zadawano mi pytanie, czy system VITEK® 2 oznacza „rzeczywiste” lub „prawdziwe” wartości MIC. Aby odpowiedzieć na to pytanie, trzeba najpierw zastanowić się, czym jest „prawdziwa” wartość MIC (minimalnego stężenia hamującego). Gdy zadamy pytanie mikrobiologom i pracownikom laboratorium „czym jest rzeczywista lub prawdziwa wartość MIC?”, udzielają zazwyczaj następujących odpowiedzi:

  • To wynik uzyskany przy pomocy metody referencyjnej.
  • Może zostać określona metodami manualnymi.
  • Konieczna jest inkubacja przez całą noc.
  • Nie uwzględnia obliczania wyników.
  • Istnieją studzienki zawierające antybiotyk w stężeniu odpowiadającemu każdej raportowanej wartości MIC
  • Duża liczba dwukrotnych rozcieńczeń.
  • Pozwala odróżnić organizmy typu dzikiego od organizmów typu nie-dzikiego.

Warto więc rozważyć różne definicje „rzeczywistych” i „prawdziwych” wartości MIC.

Czy wynik musi być uzyskany przy pomocy metody referencyjnej?

Jeśli tak, to zdecydowana większość systemów do diagnostyki in vitro (IVD) nie może zostać uznana za systemy do określania „rzeczywistych” lub „prawdziwych” wartości MIC. Jako takie mogą zostać uznane tylko te metody, które dokładnie przestrzegają wytycznych: International Organization for Standardization (ISO) 20776-1: 2006 (E) 1 lub Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M07-A102. Istnieje bardzo niewielu producentów systemów IVD, które rzeczywiście oferują referencyjne panele MIC. Zgodnie z wymaganiami ISO i CLSI muszą one być w stanie zamrożonym. Na przykład panele w postaci suchej nie mogą zostać uznane za równoważne z metodą referencyjną. Zatem powyższa definicja wprowadza znaczące ograniczenia.

Czy to oznacza, że wyniki można określić wyłącznie metodami manualnymi i konieczna jest inkubacja przez noc? Czy metoda nie może uwzględniać obliczania wyników?

Czy systemy IVD pozwalające na określenie wartości MIC metodami manualnymi, wymagające inkubacji przez całą noc i/lub nieuwzględniające obliczania wyników naprawdę pozwalają uzyskać wartości MIC, które są bardziej „rzeczywiste” lub „prawdziwe”, niż w przypadku systemów, które nie stosują powyższych zasad? Urządzenia do badań lekowrażliwości drobnoustrojów muszą charakteryzować się osiągami równoważnymi z metodą odniesienia, ale nie muszą stosować samej metody referencyjnej.

Weźmy pod uwagę fakt, że wszystkie systemy, które nie stosują metody referencyjnej wymagają przeprowadzenia badań klinicznych (czyli badania ich charakterystyki), aby wykazać równoważność z metodą referencyjną i uzyskać zezwolenie amerykańskiej agencji FDA (United States Food and Drug Administration) na dopuszczenie wyrobu do obrotu lub znak CE. Obejmuje to tradycyjne tacki z 96 studzienkami w przypadku panelu suchego. W takich przypadkach (niezależnie od tego, w jaki sposób oblicza się wartości MIC) prawdziwym wskaźnikiem wiarygodności systemu są podawane w ulotce technicznej dane informujące o wynikach badań klinicznych dotyczących charakterystyki wyrobu w odniesieniu do złotego standardu metody referencyjnej.

Amerykańska agencja FDA oraz ISO mają podobne, bardzo surowe kryteria dotyczące systemów so określania lekowrażliwości drobnoustrojów IVD, które muszą zostać spełnione, by wyrób został dopuszczony do obrotu lub spełnił wymogi rejestracyjne, niezależnie od przyjętej metodologii.

  • > 90% podstawowej zgodności (PZ, czyli procent wyników, dla których wartość MIC dla metody badawczej odpowiada ± 1 dwukrotnemu rozcieńczeniu dla metody referencyjnej).
  • >90% zgodności kategorii (czyli procent wyników, dla których kategoria wrażliwy (S), średniowrażliwy (I) lub oporny (R) wynikająca z interpretacji wartości MIC dla metody badawczej odpowiada kategoriom S, I lub R metody referencyjnej).
  • <3.0% dużych błędów dla izolatów wrażliwych (błąd duży powstaje, gdy izolaty oznaczone jako S metodą referencyjną zostały zinterpretowane jako R metodą badawczą).
  • FDA oraz ISO mają odmienne wartości dla dopuszczalnej liczby bardzo dużych błędów (VME). (bardzo duży błąd – VME – powstaje, gdy izolaty oznaczone jako R metodą referencyjną zostały zinterpretowane jako S metodą badawczą)
    • Kryteria regulacyjne FDA wymagają, by liczba bardzo dużych błędów dla izolatów opornych określana była wyłącznie w oparciu o zaproponowane kryteria statystyczne obejmujące dolną i górną wartość 95% przedziału ufności , które dla bardzo dużego błędu wynoszą odpowiednio <7,5% i <1,5%.
    • Wymagania ISO określają wyłącznie zasadę <3,0% liczby bardzo dużych błędów dla izolatów opornych.
Informacje szczegółowe dotyczące kryteriów amerykańskiej agencji FDA zostały podane w: 2009 Class II Special Controls Guidance Document: Antimicrobial Susceptibility Test (AST) Systems3. A informacje szczegółowe dotyczące wymagań ISO zostały podane w: ISO 20776-2: 2007 (E)4.

VITEK® 2 został dopuszczony do obrotu przez amerykańską agencję FDA i posiada znak CE, co oznacza, że uzyskiwane przy jego pomocy wartości MIC odpowiadają wartościom uzyskanym przy pomocy metody referencyjnej. I chociaż wyniki lekowrażliwości VITEK® 2 AST nie są oznaczane metodami manualnymi, nie wymagają całonocnej inkubacji i podają obliczone wartości MIC, to są zgodne z wynikami metody referencyjnej, na co wskazuje znak CE dla wszystkich antybiotyków do zastosowań klinicznych oferowanych w panelach dla VITEK® 2 oraz dla większości z nich, która została dopuszczona do obrotu przez amerykańską agencję FDA.

Kolejnym argumentem potwierdzającym słuszność tego założenia, to fakt, że manualne metody określania wartości MIC są bardzo czasochłonne, a interpretacja wyników bardzo subiektywna. Wyniki lekowrażliwości uzyskiwane w systemie VITEK® 2 odzwierciedlają wyniki uzyskane metodą referencyjną, ale są także obiektywne, powtarzalne i dostępne w krótkim czasie. W rzeczywistości, wyniki uzyskiwane w systemie VITEK® 2 można uznać za bardziej znormalizowane, niż wyniki określane w systemach manualnych, ponieważ automatyczny odczyt wyników uniemożliwia wpływ ludzkiego, subiektywnego punktu widzenia na ich interpretację. Wyniki dla tego samego izolatu interpretowane są tak samo, niezależnie od tego, kto wykonuje badanie.

Czy zatem z punktu widzenia „rzeczywistych” i „prawdziwych” wartości MIC ważne jest, by każdej raportowanej wartości MIC odpowiadała studzienka zawierająca odpowiednie stężenie antybiotyku, by przeprowadzić dużą liczbę dwukrotnych rozcieńczeń i/lub możliwe było różnicowanie organizmów typu dzikiego od innych?

Najpierw kilka słów o dwukrotnych rozcieńczeniach. Sam fakt, że system fizycznie oferuje dwukrotne rozcieńczenia, nie czyni go metodą referencyjną. Na przykład, szybkie, zautomatyzowane systemy wyraźnie nie przestrzegają warunków metody referencyjnej, ponieważ wymaga ona 16 do 24 godzinnej inkubacji w zależności od kombinacji organizm/antybiotyk. Jednak dane z badań klinicznych pokazują, że uzyskane w tych systemach wyniki są zasadniczo równoważne wynikom uzyskanym metodą referencyjną.

Pożądany jest bardzo duży zakres wartości MIC. Jest on jednak często niepraktyczny, ze względu na szeroką gamę antybiotyków, które muszą zostać zbadane dla każdego izolatu. Ponieważ mechanizmy oporności na antybiotyki rozwijają się nieustannie, konieczne jest badanie coraz większej liczby antybiotyków, a miejsce na jednorazowych panelach do oznaczeń lekowrażliwości  jest ograniczone. Wiele producentów testów do oznaczeń lekowrażliwości ucieka się do stosowania tylko stężeń niezbędnych do interpretacji kategorii dla większości antybiotyków w panelu. VITEK® 2 określa zakres wartości MIC dla siedmiu dwukrotnych rozcieńczeń dla większości antybiotyków, co często obejmuje epidemiologiczne wartości odcięcia niezbędne do odróżnienia szczepów typu dzikiego od szczepów typu nie-dzikiego. Dzięki temu system oferuje jeden z największych zakresów oznaczeń wśród podobnych automatycznych systemów ID and AST. ISO i FDA określiły kryteria dla oznaczeń wartości MIC oraz systemów, które spełnia większość antybiotyków badanych w systemach VITEK® 2:

  • Zgodnie z ISO 20776-24 badanie MIC jest „badaniem, które jest w stanie określić wartość MIC dla szeregu co najmniej pięciu kolejnych dwukrotnych rozcieńczeń, dla których można określić stopień Podstawowej Zgodności (PZ)”.
  • Opublikowany przez FDA w 2009 roku dokument Class II Special Controls Guidance Document3 określa systemy MIC jako: „rozcieńczenia bulionu, rozcieńczania agaru lub inne metody i systemy, które oferują co najmniej pięć stężeń dwukrotnych rozcieńczeń antybiotyków” z dodatkowymi wymaganiami, które wyraźnie spełnia system VITEK® 2, ponieważ większość antybiotyków w systemie została dopuszczona przez agencję FDA do ilościowych badań wartości MIC, a nie do jakościowego określania kategorii (S,I,R).
  • FDA określa również systemy wykorzystujące wartości odcięcia (breakpoints) jako: „Systemy podobne do systemów przeznaczonych do oznaczeń wartości MIC, ale z czterema lub mniejszą liczbą stężeń każdego antybiotyku. Stężenia te to progi interpretacyjne (w oparciu o określone przez FDA interpretacyjne wartości kategorii MIC dla każdego antybiotyku), które pozwalają uzyskać wynik jakościowy (kategorię). FDA uważa takie systemy za systemy jakościowe.” 3

Dokąd zaprowadziły nas rozważania o „prawdziwych” wartościach MIC?

Wytyczne CLSI M07-A102 definiują „prawdziwe” wartości MIC jako: „prawdziwa” wartość MIC znajduje się gdzieś pomiędzy najniższym stężeniem badanym, które hamuje wzrost organizmu (tj. odczyt wartości MIC) i kolejnym najniższym badanym stężeniem. Jeśli, na przykład, użyto szereg dwukrotnych rozcieńczeń, a wartość MIC wynosi 16 μg/ml, to „prawdziwa” wartość MIC będzie wynosić pomiędzy 16 μg/ml a 8 μg/ml”. Jeśli stosuje się tę definicję, wtedy żaden z systemów AST (w tym metody referencyjne) nie podaje „rzeczywistych” ani „prawdziwych” wartości MIC. A w końcu najważniejszym aspektem jest fakt, czy wartość MIC została określona dokładnie!

Jaka jest konkluzja dotycząca oznaczeń wartości MIC i systemów VITEK® 2?

Następnym razem, gdy konieczne będzie pytanie, czy wartości MIC uzyskiwane w systemie do oznaczeń lekowrażliwości są „prawdziwe”, należy pamiętać, że w celu uzyskania znaku CE oraz zgody agencji FDA na wprowadzenie wyrobu do obrotu, konieczne jest, by wyniki badania odpowiadały wynikom uzyskanym przy pomocy metody referencyjnej (o czym świadczą wyniki badania klinicznego dostarczane wraz z produktem). Dane te są wymagane przez prawo i są tworzone przez każdego producenta systemów do oznaczeń wartości MIC niewykorzystujących metody referencyjnej w celu udowodnienia równoważności z metodą referencyjną. Dlatego lepiej jest, gdy system do oznaczeń lekowrażliwości, tak jak VITEK® 2, podaje dokładne, powtarzalne i szybko dostępne wartości MIC, a jednocześnie pozytywnie wpływa na procedury pracy laboratorium.

Literatura

  1. ISO.  Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems – Susceptibility test of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices –Part 1:  Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases-First Edition.  ISO document 20776-1.  Switzerland:  ISO; 2006.

  2. CLSI. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically; Approved Standards, 10th Ed. CLSI document M07-A10. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2015.

  3. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Devices and Radiological Health.  Class II Special Controls Guidance Document:  Antimicrobial Susceptibility Test (AST) Systems. https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/class-ii-special-controls-guidance-document-antimicrobial-susceptibility-test-ast-systems.  U.S. Department of Health and Human Services; 2009.

  4. ISO.  Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems – Susceptibility test of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices – Part 2:  Evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices-First Edition.  ISO document 20776-1.  Switzerland:  ISO; 2007.

Akronimy:

  • S: wrażliwy

  • I: średniowrażliwy

  • R: oporny