V první části této série článků o minimální inhibiční koncentraci (MIC) jsme se zaměřili na význam pojmu „skutečná“ nebo „reálná“ hodnota MIC. Ukázali jsme si, že převážná většina komerčních automatizovaných ID and AST systémů nedodržuje protokoly podle normy Mezinárodní organizace pro normalizaci (ISO) 20776-1:2006 (E)1 nebo podle referenční metody M07-A10 Ústavu pro klinické a laboratorní standardy (CLSI). Výrobci automatizovaných systémů proto musí uvádět údaje o účinnosti klinických hodnocení pro  určení shody s referenční metodou. To  jasně prokazuje, že generované hodnoty MIC velmi těsně korelují se svými referenčními protějšky. V tomto článku budeme zkoumat, jaký typ hrubých údajů je shromažďován systémem VITEK® 2 a jak jsou tyto údaje převáděny na přesnou hodnotu MIC.

Jak se monitoruje růst organismu?

Izoláty pacientů jsou testovány na přístroji VITEK® 2 pomocí jedné samostatné jednorázové karty AST (Obrázek 1) na každý izolát. Na každé kartě je přítomna alespoň jedna pozitivní kontrolní jamka bez antibiotika (obsahující pouze živnou půdu podporující růst) a několik jamek se zvyšující se koncentrací různých antibiotik v živné půdě.

VITEK® 2 kontinuálně monitoruje růst ve všech jamkách. Růst v pozitivní kontrolní jamce je monitorován tak dlouho, dokud není detekován předem stanovený minimální bakteriální růst měřený na základě zákalu (tj. procentuální změna jednotek hrubé transmitance – %ΔRTU). Růst v kontrolní jamce ukazuje, že testovaný izolát je životaschopný a roste vhodnou rychlostí umožňující zahájení analýzy různých jamek s obsahem  léčiva.  Čtení testované karty probíhá každých 15 minut, dokud nedojde k ukončení testu citlivosti.

Jak je znázorněno na obrázku 2, růst organismu se měří několika způsoby v jamce s pozitivní kontrolou i v jamkách s antibiotiky. Relativní růst organismu v každé jamce s antibiotiky se dále srovnává s růstem v pozitivních kontrolních jamkách.

 


Obr. č. 1: VITEK® 2 AST Card
Klikněte pro zvětšení


Obr. č. 2: Princip stanovení MIC na přístroji VITEK® 2
Klikněte pro zvětšení

 

Jak se stanovuje hodnota MIC?

Hodnota MIC se stanovuje porovnáním růstu izolátů od pacienta s růstem izolátů o známých hodnotách MIC uloženém v databázi systému. Představme si, že máme v  systému VITEK® 2 uloženou standardní křivku, která se používá k porovnání referenční hodnoty MIC s aktivitou organismu v jamkách s antibiotiky.

Je důležité mít na paměti, že „standardní křivky“ v systému VITEK® 2:

  • Jsou vícerozměrné, protože VITEK® 2 průběžně kontroluje více parametrů (na rozdíl od odečtu jednoho ukazatele po inkubaci přes noc)
  • Byly vytvořeny pomocí > 1800 gramnegativních organismů a > 1200 grampozitivních organismů s různými mechanismy ATB rezistence

Vzhledem k tomu, že VITEK® 2 kontinuálně sleduje růst v průběhu času a používá k vyhodnocení růstu více parametrů (na rozdíl od odečtu jednoho ukazatele po inkubaci přes noc), není nutné mít k dispozici jamku pro každou hodnotu MIC, resp. není nutné testovat každou dílčí koncentraci, která může být hlášena. Jedna jamka je schopna poskytnout informace pro více než jednu hodnotu MIC, protože aktivita organismu v jamce může být interpretována v měřítku, které je informativnější než prostý závěr o přítomnosti či nepřítomnosti růstu.

Jaký význam má kontinuální sledování?

Pro ilustraci kontinuálního sledování aktivity organismu se podívejme na test VITEK® 2 AST, který může hlásit hodnoty MIC při dvojnásobném ředění pro rozsah koncentrací antibiotik od ≤ 0,25  mg/l do ≥ 8  mg/l. Grafy 1 až 6 ilustrují vztah mezi daty generovanými systémem VITEK® 2 a výsledky získanými referenční metodou.

Každý graf znázorňuje růst pozorovaný systémem VITEK® 2 pro konkrétní organismus s různými referenčními hodnotami MIC. Jedním z prvních pozorování při prohlížení grafů je skutečnost, že růstovou aktivitu při různých koncentracích antimikrobiálních látek můžeme interpretovat podrobněji, než je pouhé hlášení o přítomnosti či nepřítomnosti růstu. Již při použití pouhých tří koncentrací může VITEK® 2 rozpoznat šest jedinečných vzorů růstu, které umožňují hlásit šest různých hodnot MIC.

Další klíčovou funkcí analýzy VITEK® 2 je schopnost standardizovat data pro testovaný organismus porovnáním růstu při každé antimikrobiální koncentraci s růstem v kontrolní jamce. Tento krok je nezbytný ke stanovení relativního růstu organismů, protože tvar růstových křivek je různý u různých typů organismů. Délka lag fáze, strmost změny během exponenciální fáze a velikost změny během exponenciální fáze přispívají k tomu, že lze organismu přiřadit jedinečnou množinu růstových charakteristik.

Pro lepší porozumění procesu standardizace dat se podívejme například na růst v jamce 0,5  mg/l ve srovnání s růstem v růstové kontrolní jamce v grafu 2. Tento organismus má referenční hodnotu MIC 0,5 mg/l . Růst při koncentraci 0,5 mg/l představuje přibližně 60 % růstu v růstové kontrolní jamce. V grafu 3 má však daný organismus referenční hodnotu MIC 1 mg/l a jeho aktivita při koncentraci 0,5 mg/l představuje 95 % aktivity v samotném růstovém médiu. Tyto procentuální hodnoty nebo relativní hodnoty růstu organismu jsou využívány přístrojem VITEK® 2 ke stanovení přesných hodnot MIC.


Grafy 1-6
Klikněte pro zvětšení

Například tabulka 1 níže shrnuje analýzu relativního růstu organismů na přístroji VITEK® 2 pro data v grafech 1 až 6. Tabulka uvádí číselný vztah mezi růstem organismu stanoveným na přístroji VITEK® 2 a referenčními hodnotami MIC.

Organismus/graf Referenční číslo

MIC

 Koncentrace antimikrobiální látky
0.5 2.0 8.0
1 ≤ 0.25 3% 2% 1%
2 0.5 60% 3% 1%
3 1.0 90% 8% 2%
4 2.0 95% 50% 8%
5 4.0 99% 92% 9%
6 ≥ 8.0 100% 100% 99%

Tabulka 1: Relativní růst organismu v jamce s antimikrobiální látkou ve srovnání s růstem v růstové kontrolní jamce vyjádřený v procentech

Vynesením hodnot relativního růstu organismů u velkého souboru organismů pro 3 antimikrobiální koncentrace uvedené v tabulce 1 (0,5, 2 a 8  mg/l) získáme diagram 1. Diagram 1 slouží jako standardní křivka a:

  • Každý rozměr představuje relativní růst při jedné koncentraci antimikrobiální látky
  • Každý kosočtverec představuje bod odpovídající třem hodnotám relativního růstu pro daný organismus

Různě barevné klastry představují množinu organismů s referenčním rozmezím MIC od 0,25  mg/l do ≥ 8,0 mg/l.


Diagram 1: Relativní růst organismů v rámci velké množiny organismů
Každý kosočtverec představuje jeden organismus

Například kosočtverec pro údaje odpovídající tabulce 1 – grafu 3 by se nacházel v bodě (90 %, 8 %, 2 %). Hodnota 90 % by se vynesla na osu 0,5  mg/l, hodnota 8 % na osu 2,0  mg/l a hodnota 2 % na osu 8,0  mg/l.  Vzhledem k tomu, že daný organismus má hodnotu MIC 1,0  mg/l, bude barva kosočtverce červená (na základě referenční barevné legendy MIC uvedené v pravé horní části diagramu). Celkově trojrozměrný diagram znázorňuje jedinečnou schopnost analyzátoru VITEK® 2 rozlišovat mezi šesti různými hodnotami MIC při pouhých třech koncentracích antimikrobiální látky. Dále je patrné, jak určení relativního růstu organismů umožňuje systému VITEK® 2 zohlednit jedinečné růstové charakteristiky každého organismu ke stanovení hodnoty MIC.

Průběžné sledování aktivity organismu pomáhá stanovit hodnotu MIC a inkubační dobu potřebnou pro daný organismus v systému VITEK® 2. Pokud má analytický software informace o tom, kdy organismus přechází z lag fáze do fáze exponenciální, může určit vhodnou inkubační dobu na základě růstu, který vykazuje každý organismus. Zde je postup:

  1. Na konci lag fáze v kontrolní růstové jamce přístroj VITEK® 2 čeká určitou předem stanovenou dobu
  2. Po uplynutí této doby VITEK® 2 zkontroluje, zda je přítomen růst v jamce s nejnižší koncentrací antibiotika
  3. Pokud je během této časové periody růst stále přítomen, VITEK® 2 prodlouží inkubaci o další předem stanovený časový interval, aby bylo možné vyhodnotit růst i ve zbývajících koncentracích.
  4. Tento proces s prodlužováním inkubační doby pokračuje tak dlouho, dokud:
    • nepřestane být přítomen významný růst, nebo
    • dokud nebude pozorován růst při nejvyšší ATB koncentraci

Při použití tohoto algoritmu může VITEK® 2 používat relativně krátkou inkubační dobu pro většinu organismů, protože v konečném důsledku je délka inkubace určena chováním organismu. Po detekci růstu se přístroj jednoduše přizpůsobí. S tím je spojena i další výhoda spočívající ve schopnosti detekovat pozdní rezistenci.

Co říci na závěr?

Přístup využívaný přístrojem VITEK® 2 se odchyluje od tradičních přístupů – nicméně tradice není cílem vědecké práce. Naopak, musíme vždy hledat účinnější, efektivnější a přesnější způsoby řešení problémů. Přístroj VITEK® 2 kontinuálně sleduje aktivitu organismů, a proto může stanovit délku inkubace a určit hodnotu MIC rychleji než tradiční metody. Při posuzování klinických studií bylo opakovaně prokázáno, že tento proces poskytuje přesné a reprodukovatelné výsledky.